Versuchsprotokoll: Messung der Responsivität von TLR9 auf extrazelluläre Stimuli mittels Luziferase-Reportergen-Assay

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Praktikumsbericht / -arbeit aus dem Jahr 2011 im Fachbereich Biologie - Humanbiologie, Note: 1, Philipps-Universität Marburg, Sprache: Deutsch, Abstract: Die Zellen des Immunsystems besitzen unterschiedliche Strategien zur Reaktion aufextrazelluläre Stimuli (z.B. Pathogene). Beginnend bei der Bindung des Antigens durch einenspezifischen Rezeptor wird eine intrazelluläre Signalkaskade in Gang gesetzt, die zumeist ineiner Aktivierung von Trankskriptionsfaktoren (TF) resultiert. Diese TF vermitteln schließlichim Nukleus die transkriptionelle Aktivierung von Zielgenen. Eine Rezeptorfamilie mitwichtiger Funktion bei der Immunantwort auf verschiedene Pathogene sind die sog. „tolllike“Rezeptoren (TLR), deren Stimulation über die Aktivierung von Signaltransduktoren, z.B.des nukleären TF κB (NF-κB) im Falle des TLR9, die Bildung von proinflammatorischenZytokinen befördert.Das Ziel dieses Versuchs war die Untersuchung der Stärke der Aktivierung von NF-κB alsReaktion des TLR9 auf unterschiedliche Antigene, um dadurch Aussagen über dienatürlichen, spezifischen Liganden des Rezeptors treffen zu können.In dem durchgeführten Versuch wurden TLR9-exprimierende HEK293-Zellen („humanembryonic kidney cells“) verwendet und mit Plasmiden transfiziert, die für das EnzymLuziferase kodierende Gene enthielten, deren Promotoren eine NF-κB-spezifischeErkennungssequenz aufwiesen. Die Auslösung der TLR9-Signalkaskade durch ein passendesAntigen sollte sich daher in der Bildung von aktivem NF-κB niederschlagen und in der Folgedie Transkriptionsaktivität des Reporterenzyms Luziferase erhöhen. Durch die Zugabe vonLuziferin, das bei der Umsetzung durch die Luziferase bioluminesziert, war es aufgrund derKorrelation der Stärke eines TLR9-Stimulus mit dem bei der Reaktion emittierten Lichtmöglich, die immunologische Reaktion von TLR9-exprimierenden Zellen auf diverse Antigenezu untersuchen.Mit dieser Technik wurden die bakteriellen Antigene Lipopolysaccharid (LPS) und Pam3Cys,PolyIC, ein Analogon viraler dsRNA, sowie die Oligodesoxynukleotide (ODN) 1668 (mitnormalem CpG-Motiv) und 1720 (mit invertiertem CpG-Motiv) auf ihre Interaktion mit demTLR9 getestet.